1.     Краткое описание выполненных работ научного исследования План НИР 2014 года выполнен. В отчетном году проведены следующие научные исследования: Проведены исследования, направленные на модификацию и улучшение адгезионных свойств поверхности полимерных изделий и клеточных носителей (матриксов) из разрушаемых полигидроксиалканоатов (ПГА) обработкой физическими методами (воздействие кислородной и аммиачной плазмой, лазерная резка). Плазменную обработку проводили на установке DIN A3 (Германия) в плазме тлеющего разряда с частотой генератора 13,56 МГц, используя две реактивные среды (кислород и аммиак); мощность обработки варьировала от 50 до 250 Вт при давлении 30 Па (300 мкбар) в течение 20 мин. Лазерную резку пленок и 3D пористых матриксов проводили с использованием СО2-лазера LaserPro Explorer II (Coherent, США) с длиной волны 10,6 мкм с максимальными мощностью 30 Вт и скоростью 80 дюймов в секунду при варьировании мощности от 5 до 55% от максимальной и скорости от 40 до 100% от максимальной; с фокусировкой и в расфокусированном режиме. Химическую модификацию поверхности проводили с использованием окислителей и реагентов, вызывающих образование на поверхности карбоксильных и гидроксильных групп, двойных связей (NaOH, H2SO4, HCl, HNO3, NH3, H2O2, NaBH4). Последствия обработки исследовали с применением РЭМ, измерением величины контактных краевых углов (прибор «Krüss DSA-25E» измерением краевых углов капель воды и дийодметана методом Оунса-Вендта-Рабеля-Кьельбле) с последующей обработкой данных с помощью программы DSA-4; в культуре фибробластов с применением РЭМ, флуоресцентных красителей и МТТ-теста.
С применением полимерных растворов исследовали способы формирования покрытий на поверхности полипропиленовых сетчатых эндопротезов «Эсфил» (фирмы «Линтекс», Россия). Покрытия наносили: 1) техникой испарения растворителя многократным погружением сеток в 1%-ный раствор полимера с последующим высушиванием в ламинарном потоке воздуха при комнатной температуре; 2) нанесением раствора полимера на поверхность изделия под давлением с применением техники аэрографии; 3) с предварительным нанесением на поверхность первичного слоя поли-n-ксилена («Parylen N»-Vitek Res. Coip, США) из газовой фазы при давлении 10-20 атм. в установке Labcoater PDS 2010 (США) с последующим формированием второго слоя покрытия из ПГА. Для нанесения полимерных покрытий на металлические изделия медицинского назначения (хирургические спицы) металлическую поверхность обезжиривали; раствор полимера наносили методом испарения растворителя, методом осаждения полимера из раствора, комбинированным методом. Для конструирования опорных клеточных носителей (эластичные пленки, нетканые мембраны, пористые 3D матриксы) использовали ПГА различной химической структуры и применяли различные методы; исследовали структуру, физико-химические, физико-механические и биологические свойства изделий. Методы дифференцировки клеток предшественников в клетки эпидермального и остеобластического ряда отрабатывали с использованием ММСК костного мозга и из жировой ткани. Для подтверждения дифференцировки клеток использовали метод ПЦР «в реальном времени» в комбинации с методом обратной транскрипции (ОТ) для количественной оценки экспрессии генов к факторам дифференцировки: коллаген 1-го типа (Сol-1), кератин 10 (К10), кератин 14 (К14), остеокальцин (BGP). Для восстановления реконструктивного тканегенеза получены гибридные тканеинженерные конструкции (графты) в виде: 1) пленочных и мембранных систем, образованных ультратонкими волокнами, полученные методом ЭСФ, несущими дифференцированные эпидермальные или остеобластические клетки, предназначенные для восстановления дефектов кожных покровов, и 2) 3D пористые имплантаты в комбинации с остеобластами для реконструктивного остеогенеза.
Доклинические исследования включали оценку эффективности применения разработанных из разрушаемых ПГА изделий для реконструктивной хирургии. Эксперименты выполнены в соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993-1-2009 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий». Полимерные нетканые мембраны, полученные методом ЭСФ из 3-компонентных ПГА новых типов, образованных мономерами 3ГБ/3ГВ/4ГБ и 3ГБ/3ГВ/3ГГ и аналогичные изделия в сочетании с дифференцированными эпидермальными клетками (графты), исследовали в качестве раневого покрытия для восстановления хирургических повреждений дермы лабораторных животных в сравнении с коммерческой повязкой «Воскопран». Гидрофобные не прилипающие к ранам эластичные нетканые мембраны из сополимеров 3ГБ/4ГБ исследовали на модели ожоговой раны II лабораторных животных в сравнении с лиофилизированной коллагеновой повязкой, применяемой в комбустиологии. Пористые 3D имплантаты из П3ГБ и полимерные конструкции в сочетании с остеобластами, дифференцированными из ММСК жировой ткани, исследованы в течение 120 суток на модели дефекта плоских костей черепа в теменной области крыс линии Вистар. В отчетном году продолжена передача разработанных по планам НИР проекта экспериментальных и опытных образцов изделий медицинского назначения из разрушаемых полимеров (ПГА) для исследований в клинических условиях.
Семейство опытных образцов изделий из ПГА (торговая марка материала и изделий «Биопластотан») прошло сертификацию в органах Росстандарта. На основе анализа выполненных комплексных исследований разработаны практические рекомендации для проведения многоцентровых клинических испытаний изделий и конструкций из разрушаемых ПГА, предназначенных для реконструктивных технологий. 2.     Краткое описание полученных научных результатов При исследовании возможностей модификации поверхности полимерных изделий из ПГА лучшие результаты, обеспечившие повышение гидрофильности и адгезионных свойств поверхностей, получены при обработке поверхностей в плазме тлеющего разряда O2, и NН3 с частотой генератора 13,56; определены условия, обеспечившие снижение величины углов на 25-30о от исходной (до 51 и 45о) при значениях свободной поверхностной энергии по 54 мН/м. Лазерная обработка наливных пленок и прессованных 3D пластин при варьировании мощности от 1,5 до 16,5 Вт и скорости от 32 до 80 дюймов в секунду в фокусированном и расфокусированном режимах, обеспечила получение перфорированных носителей без существенного изменения величины краевых углов. Из исследованных химических реагентов наибольшей активностью обладал спиртовой раствор NaOH, приводивший к увеличению СПЭ до 41 мН/м. Более мягким воздействием обладал водный раствор NaOH, также приводящий к значительному возрастанию полярной составляющей СПЭ при длительной обработке (30 минут – 2 ч) при сохранении механических характеристик образцов. При использовании H2SO4 незначительно увеличивалась только полярная составляющая СПЭ; при обработке концентрированным раствором HCl отмечено уменьшение СПЭ до 33 мН/м. Данные электронной микроскопии и результаты МТТ-теста показали, что исследованные методы модификации (за исключением обработки НСl) повышают адгезионные свойства поверхности, стимулируют прикрепление и рост клеток. Разработаны методы формирования биосовместимых полимерных покрытий (использован поли-3-гидроксибутират) на поверхности полипропиленовых сетчатых эндопротезов «Эсфил» (фирмы «Линтекс», РФ) и хирургических спиц, применяемых в ортопедии и травматологии. При использовании техники испарения растворителя и поли-n-ксилена получены лучшие результаты, обеспечившие формирование однородных покрытий, равномерных по толщине, стойких к истиранию. В культуре фибробластов NIH 3T3 и экспериментах на лабораторных животных показано, что применение покрытий повышает биосовместимость эндопротезов, стимулируя адгезию и рост клеток и снижая реактивные изменения тканей. Выполненными исследованиями обоснованы и экспериментально реализованы различные способы модификации поверхности изделий медико-биологического назначения из разрушаемых ПГА с помощью физических и химических методов, позволяющие позитивно влиять на свойства поверхности без разрушения материала.
Сконструировано семейство клеточных носителей из 3-х-компонентных ПГА, образованных мономерами 3ГБ/3ГВ/4ГБ и 3ГБ/3ГВ/3ГГ с макровключениями 4-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата и двух компонентных П(3ГБ/4ГБ), которые имели пониженную степень кристалличности и большую эластичность, что обеспечивало высокие адгезию и пролиферацию клеток. Отработаны методы дифференцировки клеток предшественников (ММСК костного мозга и жировой ткани) и получены дифференцированные клетки остеобластического и эпидермального ряда. Дифференцировка клеток подтверждена метод ПЦР «в реальном времени» в комбинации с методом обратной транскрипции (ОТ) количественной оценкой экспрессии генов к факторам (коллаген 1-го типа (Сol-1), кератин 10 (К10) и кератин 14 (К14), остеокальцин (BGP)). Сконструированные гибридные тканеинженерные конструкции (графты): 1) гибкие пленки и нетканые мембраны, образованные ультратонкими волокнами, полученные методом ЭСФ, несущие дифференцированные эпидермальные клетки или культуру диплоидных клеток эмбриона человека (ЛДКЧ) – фибробласты линии М-22, предназначены для восстановления дефектов кожных покровов и 2) 3D-пористые имплантаты в комбинации с остеобластами, дифференцированными из жировой ткани, - для реконструктивного остеогенеза. В серии выполненных доклинических исследований на лабораторных животных установлено, что полимерные нетканые мембраны из 3-х-компонентных ПГА и аналогичные мембраны в сочетании с дифференцированными эпидермальными клетками более эффективны для восстановления хирургических повреждений дермы по сравнению с коммерческими повязками «Воскопран», обеспечивая более раннее и полное восстановление дефекта при меньшем воспалительном ответе тканей на фоне более активных васкулиризации и формировании новой соединительной ткани в месте повреждения. Гидрофобные не прилипающие к ранам эластичные прозрачные нетканые мембраны из сополимеров 3ГБ/4ГБ положительно оценены в ходе сравнительного исследования на модели ожоговой раны II степени лабораторных животных в сравнении с лиофилизированной коллагеновой повязкой. Регенерация кожи под экспериментальными покрытиями по срокам и течению процесса сопоставима с коллагеновой повязкой и пригодна в качестве ее эквивалента при лечении ожоговых ран II степени. Пористые 3D имплантаты из П3ГБ и полимерные конструкции в сочетании с остеобластами, дифференцированными из ММСК жировой ткани, исследованы на модели дефекта плоских костей черепа лабораторных животных по сравнению с костнопластическим материалом «Коллапол». По результатам компьютерной томографии спустя 120 суток полное закрытие дефекта произошло только при использовании 3D имплантата в сочетании с клетками. При применении полимерного имплантата и коммерческого препарата закрытие дефекта зарегистрировано, соответственно, на уровне 98 и 70%. Серия опытных образцов полимерных изделий в виде резорбируемых дренажных трубчатых эндопротезов, модифицированных сетчатых эндопротезов и нетканых мембран передана на клинические кафедры Красноярского государственного медицинского университета им. проф. Войно-Ясенецкого. Получены сертификаты соответствия Красноярского регионального отделения Росстандарта, регламентирующие серийный выпуск полимерных изделий. Разработаны практические рекомендации для многоцентровых клинических испытаний: 1) костнозамещающих материалов, имплантатов из ПГА и в композиции с клетками остеобластического ряда, обладающих остеоиндуктивными и остеопластическими свойствами для замещения дефектов костной ткани; 2) нетканых мембран из ультратонких волокон и гибких пленок из сополимерных ПГА в качестве раневых покрытий для восстановления дефектов кожных покровов (ожоги II степени, повреждения дермы).
3.     Достигнутые значения показателей эффективности выполнения научного исследования Количество кандидатов наук, постоянно работающих в составе научного коллектива лаборатории – 3. Количество аспирантов, обучающихся в вузе/научном учреждении, постоянно работающих в составе научного коллектива лаборатории – 5. Количество студентов, обучающихся в вузе, постоянно работающих в составе научного коллектива лаборатории – 4. Количество статей, опубликованных членами научного коллектива в научных изданиях, индексируемых в базе данных Web of Science, по направлению научного исследования – 6. Количество новых образовательных программ (курсов), созданных и внедренных в образовательный процесс членами научного коллектива по направлению научного исследования за отчетный период – 3. Количество членов научного коллектива, принятых в аспирантуру и докторантуру по направлению научного исследования, или утвержденных в качестве соискателей ученых степеней за отчетный период – 1. Количество молодых ученых, специалистов и преподавателей (кандидатов наук в возрасте до 35 лет и докторов наук в возрасте до 40 лет, специалистов и преподавателей без ученой степени в возрасте до 30 лет) из сторонних организаций, прошедших профессиональную переподготовку или повышение квалификации в лаборатории по направлению научного исследования за отчетный период – 2. Количество объектов интеллектуальной собственности, документы об охране которых получены организацией за отчетный период по направлению научного исследования – 5. Количество грантов, полученных за отчетный период по направлению научного исследования, руководителями которых являются члены научного коллектива – 2. Количество коммерческих договоров/контрактов, полученных и выполненных членами научного коллектива по направлению научного исследования за отчетный период – 1.